การวิเคราะห์โปรตีนในอาหาร

       การวิเคราะห์หาปริมาณโปรตีนในระยะเวลาหลายปีที่ผ่านมาทำโดยการวิเคราะห์หาปริมาณไนโตรเจนทั้งหมดที่มีอยู่ในตัวอย่าง เช่น วิธีคเจล ดาห์ล ( Kjeldahl ) ซึ่งพัฒนาโดย Johann Kjeldahl ในช่วงปี ค.ศ.1800 เป็นวิธีที่อาศัยการย่อยสลายสารอินทรีย์ในอาหารให้ปลดปล่อยไนโตรเจนออกมา ซึ่งต่อมาไนโตรเจนนี้จะถูกเปลี่ยนให้เป็นแอมโมเนีย โดยปริมาณของแอมโมเนียที่ได้เป็นตัวบ่งบอกถึงปริมาณไนโตรเจน วิธีนี้เป็นวิธีที่ได้รับการยอมรับว่ามีความแม่นยำ สามารถใช้ได้กับอาหารหลากหลายชนิด ส่วนอีกวิธีหนึ่งที่ได้ผลใกล้เคียงกันและได้รับความนิยมในวงการอุตสาหกรรมอาหาร คือ วิธีดูมาส ( Dumas ) ซึ่งอาศัยการเผาไหม้สารตัวอย่างเพื่อให้ปลดปล่อยไนโตรเจนออกมาเช่นเดียวกัน โดยทั้งสองวิธีนี้ได้รับการรับรองโดย The Association of Analytical Communities (AOAC) และนิยมใช้กันอย่างแพร่หลายในการหาปริมาณไนโตรเจนทั้งหมด แต่อย่างไรก็ตามทั้งสองวิธีนี้ยังไม่ถูกต้องมากนักสำหรับการวิเคราะห์หาปริมาณโปรตีน เนื่องจากการอาศัยหลักสมมติฐานที่ว่า “ แหล่งของไนโตรเจนหมดทั้งที่อยู่ในอาหารมาจากกรดอะมิโนซึ่งเป็นโครงสร้างหลักของโปรตีน ” และ “ องค์ประกอบหลักของอาหารประกอบด้วยคาร์โบไฮเดรตและไขมัน ซึ่งเป็นสารที่ไม่มีไนโตรเจนเป็นองค์ประกอบ ” แต่เนื่องด้วยวิธีนี้เป็นการนับจำนวนไนโตรเจนทั้งหมด ทั้งที่มาจากโปรตีนและไม่ใช่โปรตีน ดังนั้นสมมติฐานนี้จะเป็นจริงต่อเมื่ออาหารที่นำมาวิเคราะห์นั้นไม่มีการเจือปนสารประกอบอื่นที่ไม่ใช่โปรตีน

       ทั้งนี้ ปริมาณไนโตรเจนที่หาได้จะต้องนำไปคำนวณต่อด้วยการคูณกับค่าคงที่เพื่อให้ได้ปริมาณโปรตีนทั้งหมด โดยพื้นฐานของการวิเคราะห์หาปริมาณโปรตีน ในปัจจุบันสรุปได้ว่าค่าเฉลี่ยของไนโตรเจนในโปรตีนอยู่ที่ร้อยละ 16 ดังนั้นในการคำนวณหาปริมาณโปรตีน ซึ่ง คูณค่าคงที่เพียงค่าเดียว อาจทำให้เกิดความผิดพลาดในการวิเคราะห์ เนื่องจากเหตุผล 2 ข้อคือ

1. ไนโตรเจนที่ได้ทั้งหมด ไม่ใช่ไนโตรเจนที่มาจากโปรตีนในอาหาร เพราะว่าไนโตรเจนสามารถพบได้ในสารประกอบอื่นๆ ในปริมาณที่แตกต่างกันไปในอาหารแต่ละชนิด เช่น กรดอะมิโนอิสระ นิวคลีโอไทด์ ครีเอทินิน และโคลีน ซึ่งสารประกอบเหล่านี้ เรียกว่า สารประกอบไนโตรเจนที่ไม่ใช่โปรตีน ( Non-Protein Nitrogen; NPN )
2. ปริมาณของไนโตรเจนในกรดอะมิโนแต่ละชนิด (ร้อยละโดยน้ำหนัก) มีค่าแตกต่างกัน ขึ้นอยู่กับน้ำหนักโมเลกุลของกรดอะมิโนแต่ละชนิด และจำนวนอะตอมของไนโตรเจนที่เป็นองค์ประกอบซึ่งอยู่ในช่วงระหว่าง 1-4 ขึ้นอยู่กับชนิดของกรดอะมิโน

       จากข้อเท็จจริงดังกล่าวและความแตกต่างกันขององค์ประกอบในกรดอะมิโนในโปรตีนแต่ละชนิด จำนวนไนโตรเจนในโปรตีนสามารถเปลี่ยนแปลงได้ โดยจะอยู่ในช่วงร้อยละ 13-19 ซึ่งเท่ากับค่าคงที่ที่ใช้ในการคำนวณปริมาณโปรตีนตั้งแต่ 5.26 (1/(19/100)) ถึง 7.69 (1/13/100)) ด้วยเหตุนี้ ในปีค.ศ.1994 นักวิทยาศาสตร์ชื่อโจนส์ ( Jones, 1994 ) ได้แนะนำว่า ไม่ควรนำค่าคงที่ 6.25 มาใช้ในการหาปริมาณโปรตีน แต่ควรใช้ปริมาณไนโตรเจนคูณค่าคงที่จำเพาะของอาหารแต่ละชนิด ที่มีค่าคงที่ของโจนส์ ( Jones Factors ) อยู่ระหว่าง 5.18-6.38 ซึ่งขณะนี้มีการใช้งานกันอย่างแพร่หลาย แต่อย่างไรก็ตามอาหารที่มีสัดส่วนของสารประกอบไนโตรเจนที่ไม่ใช่โปรตีนเป็นหลัก เช่น นม เนื้อ และ ไข่ จะมีค่าคงที่แคบกว่า กล่าวคืออยู่ในช่วงตั้งแต่ 6.25-6.38 สำหรับอาหารประเภทผักจะมีค่าคงที่ในช่วงตั้งแต่ 5.7-6.25 เป็นต้น แต่ในทางปฏิบัติช่วงของความแตกต่างระหว่าง 6.25 และค่าคงที่ของโจนส์จะแคบกว่าค่าที่ปรากฏประมาณร้อยละ 1 โดยเฉพาะอย่างยิ่งในอาหารผสม

       เนื่องจากโปรตีนประกอบด้วยสายโซ่ของกรดอะมิโนที่เชื่อมต่อกันด้วยพันธะเปปไทด์ เมื่อเกิดการไฮโดรไลซ์จะได้เป็นกรดอะมิโนอิสระ ซึ่งสามารถวิเคราะห์ปริมาณได้โดยเทคนิคต่างๆ เช่น Ion-Exchange Chromatography (IEC) หรือ High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) โดยผลรวมทั้งหมดของกรดอะมิโนจะแสดงถึงปริมาณโปรตีนในอาหาร ซึ่งปริมาณโปรตีนที่ได้นี้จะเรียกว่า โปรตีนที่แท้จริง ( True protein ) โดยวิธีนี้ไม่ต้องอาศัยสมมติฐานหรือความรู้ข้างต้น ไม่ว่าจะเป็นปริมาณสารประกอบไนโตรเจนที่ไม่ใช่โปรตีนหรือปริมาณความสัมพันธ์ของกรดอะมิโน ทำให้สามารถกำจัดปัญหาเรื่องการพิจารณาค่าคงที่ที่จะนำมาใช้ออกไป แต่วิธีนี้ต้องการเครื่องมือวิเคราะห์ชั้นสูงซึ่งมีราคาแพง ใช้เวลาในการวิเคราะห์นาน ต้องมีการสกัดโปรตีนออกจากอาหารและต้องอาศัยประสบการณ์ของนักเคมีในการวิเคราะห์ผล

       ต่อมานักวิทยาศาสตร์ชาวแคนาดาได้พัฒนาเทคนิคการวิเคราะห์โปรตีนด้วย Near-Infrared Reflectance (NIR) ซึ่งอาศัยการตรวจวัดพันธะเปปไทด์ ซึ่งถือได้ว่าเป็นเทคนิคที่มีความจำเพาะสูง สามารถหลีกเลี่ยงปัญหาในการวิเคราะห์ที่มาจากสารประกอบไนโตรเจนที่ไม่ใช่โปรตีนได้ แต่ในทางปฏิบัติแล้วเทคนิคนี้สามารถใช้งานได้ดีกับการวิเคราะห์ตัวอย่างที่องค์ประกอบไม่เปลี่ยนแปลง เนื่องจากในการเริ่มต้นวิเคราะห์ต้องทำการสอบเทียบมาตรฐานกับตัวอย่างนั้นก่อน และจำเป็นอย่างยิ่งที่ต้องทำการสอบเทียบมาตรฐานใหม่ เมื่อองค์ประกอบของตัวอย่างเปลี่ยนแปลงไป ซึ่งอาจจะไม่เหมาะสมกับงานวิเคราะห์วัตถุดิบหรืออาหารที่มีองค์ประกอบไม่คงที่

       ในปี ค.ศ.1944 กลุ่มนักวิทยาศาสตร์อันประกอบด้วย Franenkel-Conrad และ Cooper ได้ค้นพบสีย้อมที่สามารถทำปฏิกิริยาจำเพาะได้กับกรดอะมิโน และต่อมาในปีค.ศ.1956 กลุ่มนักวิทยาศาสตร์อันประกอบด้วย Udy, Helzel และ Schober ได้พัฒนาวิธีการวิเคราะห์หาปริมาณโปรตีนโดยเทคนิคการดูดกลืนคลื่นแสงของสีย้อม Orange GC (OC) โดยอาศัยหลักการการเกิดปฏิกิริยาของสีย้อมกับกรดอะมิโนบนสายโซ่โปรตีนในสภาวะที่มีค่าความเป็นกรดเท่ากับ 2 ( pH= 2) โดยความเข้มแสงของผลิตภัณฑ์ที่ได้จากการทำปฏิกิริยาจะสัมพันธ์กับปริมาณโปรตีน วิธีนี้เหมาะสำหรับกระบวนการควบคุมการผลิตในโรงงานอุตสาหกรรม เนื่องจากให้ผลการวิเคราะห์รวดเร็ว ต้นทุนการวิเคราะห์ต่ำ ให้ค่าการวิเคราะห์แม่นยำ ซึ่งค่าที่ได้จะเป็นปริมาณของโปรตีนที่แท้จริงเท่านั้น ไม่รวมปริมาณของสารประกอบไนโตรเจนที่ไม่ใช่โปรตีน

       และต่อมาในปีค.ศ.1970 ได้มีการพัฒนาสีย้อมและเทคนิคในการวิเคราะห์ขึ้น ซึ่งสามารถทำปฏิกิริยาได้โดยตรงกับหมู่อะมิโนบนสายโซ่โปรตีน สารเคมีที่ใช้ไม่มีความเป็นพิษและเป็นมิตรกับสิ่งแวดล้อมตามข้อกำหนดของ USEPA โดยในการวิเคราะห์ประจุบวกของโปรตีนที่อยู่ในสภาวะกรดจะทำปฏิกิริยากับประจุลบของหมู่ Sulfonic ซึ่งเป็นสารประกอบประเภท Azo-sulfonic acid dye เกิดเป็นสารประกอบเชิงซ้อน ส่งผลให้โปรตีนนั้นตกตะกอน จากนั้นทำการคัดดแยกตะกอนออก และนำสารละลายที่เหลือจากการทำปฏิกิริยาไปวัดค่าดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 480 นาโนเมตร โดยปริมาณของสารละลายที่เหลือจากการทำปฏิกิริยาจะแปรผกผันกับปริมาณโปรตีนที่มีอยู่ในตัวอย่าง ซึ่งเทคนิคนี้ได้รับการรับรองโดยมาตรฐานต่างๆ เช่น American Association of Cereal Chemists; AACC (Method 46-14B) และ Association of Analytical Communities; AOAC (Method 967.12 Method 930.33 และ Method 930.29)

       แต่อย่างไรก็ตาม วิธีนี้ประกอบไปด้วยขั้นตอนต่างๆ หลายขั้นตอน กล่าวคือ เป็นวิธีที่ยังไม่สามารถทำงานแบบอัตโนมัติได้ จนกระทั่งในปี ค.ศ.2007 ได้มีผู้พัฒนาระบบขึ้นเพื่อรองรับการวัดปริมาณโปรตีนแบบอัตโนมัติ ( Rapid Protein Analyer ) ซึ่งรองรับขั้นตอนตั้งแต่การเตรียมตัวอย่างจนถึงการรายงานผลการวิเคราะห์ จุดเด่นของการหาปริมาณโปรตีนโดยวิธีนี้ก็คือ

• เป็นการตรวจวัดเฉพาะโปรตีนที่แท้จริงเท่านั้น ไม่ได้รวมสารประกอบไนโตรเจนที่ไม่ใช่โปรตีน
• การวิเคราะห์ทำได้อย่างรวดเร็ว และเหมาะสำหรับกระบวนการควบคุมผลิตภัณฑ์
• สารเคมีที่ใช้เป็นมิตรกับสิ่งแวดล้อม
• สภาวะการทำปฏิกิริยาไม่รุนแรง
• ใช้ได้กับตัวอย่างที่องค์ประกอบไม่คงที่ได้เป็นอย่างดี

ที่มา : Food Focus Thailand . October 2008. หน้า 42-45 .